WMS_TAXONOMY

WMS_TAXONOMY#

이 모듈은 Kraken2, Bracken 및 Sylph를 사용하여 전장 메타게놈 시퀀싱 데이터의 분류학적 분석을 위해 설계된 metaFun 파이프라인의 일부입니다.

개요#

WMS_TAXONOMY 모듈은 전장 메타게놈 시퀀싱 데이터로부터 분류학적 분류 및 풍부도 추정을 수행합니다. 이 모듈은 k-mer 매칭에 기반한 빠른 분류학적 분류를 위한 Kraken2, 종 수준에서 개선된 풍부도 추정을 위한 Bracken, 그리고 선택적으로 초고속 분류학적 프로파일링을 위한 Sylph를 활용합니다. 이 모듈은 분류학적 프로필을 샘플 메타데이터와 통합하여 다운스트림 통계 분석 및 시각화를 위한 Phyloseq 객체를 생성합니다.

모듈 실행#

# Sylph를 사용한 기본 사용법(기본 프로파일러)
(metafun) metafun -module WMS_TAXONOMY -i results/metagenome/RAWREAD_QC/read_filtered -m metadata.csv --sampleIDcolumn 1

# Sylph 대신 Kraken2/Bracken 사용
(metafun) metafun -module WMS_TAXONOMY -i results/metagenome/RAWREAD_QC/read_filtered -m metadata.csv --sampleIDcolumn 1 --profiler kraken2

# 메타데이터 열에 기반한 통계 분석 포함
(metafun) metafun -module WMS_TAXONOMY -i results/metagenome/RAWREAD_QC/read_filtered -m metadata.csv --sampleIDcolumn 1 --analysiscolumn 2

# 짧은 인수 형식 사용
(metafun) metafun -module WMS_TAXONOMY -i results/metagenome/RAWREAD_QC/read_filtered -m metadata.csv -c 1 -a 2

# 개선된 Kraken2 성능을 위한 메모리 매핑 사용
(metafun) metafun -module WMS_TAXONOMY -i results/metagenome/RAWREAD_QC/read_filtered -m metadata.csv --sampleIDcolumn 1 --profiler kraken2 --kraken_method memory-mapping

모듈 작동 순서#

이 모듈은 다음 단계를 수행합니다:

  1. 분류학적 분류 - Sylph(기본값) 또는 Kraken2 사용:

    • Sylph: 스케치를 생성하고 GTDB 데이터베이스에 대해 리드를 프로파일링

    • Kraken2: GTDB 데이터베이스를 사용하여 리드의 k-mer를 분류학적 레이블에 매핑

  2. 풍부도 추정 - Bracken 사용(Kraken2 사용 시):

    • Kraken2 결과에서 종 수준 풍부도 추정 개선

    • 상대적 풍부도 임계값에 기반하여 결과 필터링

  3. Phyloseq 객체 생성:

    • 분류학적 프로필과 메타데이터 결합

    • 통계 분석을 위한 R 호환 객체 생성

  4. 통계 분석(선택 사항):

    • 알파 다양성 분석

    • 베타 다양성 서열화

    • 차등 풍부도 테스트

매개변수#

${launchDir}은 metaFun을 실행하는 디렉토리로, 출력 기본 디렉토리로 활용됩니다.

매개변수

설명

기본값

참고

-i, --inputDir

필터링된 리드가 포함된 입력 디렉토리

"${launchDir}/results/metagenome/RAWREAD_QC/read_filtered"

필수. RAWREAD_QC 워크플로우의 출력

-m, --metadata

메타데이터 파일 경로

없음

필수. 샘플 정보가 포함된 CSV 파일

-c, --sampleIDcolumn

메타데이터의 샘플 ID 열 번호

1

필수. 리드 파일 이름의 샘플 ID와 일치

-a, --analysiscolumn

분석 그룹화를 위한 열 번호

0

선택 사항. 0으로 설정하면 통계 분석이 수행되지 않음

--profiler

사용할 분류학적 프로파일러

sylph

선택 사항. 옵션: sylph, kraken2

--kraken_method

Kraken2 방법

default

선택 사항. 옵션: default, memory-mapping

--confidence_filter

Kraken2의 신뢰도 임계값

0.1

선택 사항. 값이 높을수록 더 구체적인 분류

--relab_filter

Bracken 결과의 상대적 풍부도 필터

0.0001

선택 사항. 이 임계값 미만의 종을 필터링

--sylph_abundance_type

Sylph 출력의 풍부도 유형

relative_abundance

선택 사항. 보고할 풍부도 값의 유형

-p, --cpus

사용할 CPU 수

15

선택 사항. 시스템 기능에 따라 조정

-o, --outdir

출력 디렉토리

"${launchDir}/results/metagenome/WMS_TAXONOMY"

선택 사항. 결과가 저장될 위치

입력 및 출력#

입력#

  • 품질 제어된 페어드 엔드 메타게놈 리드(RAWREAD_QC 워크플로우의 출력)

  • 샘플 정보와 조건이 포함된 메타데이터 파일(CSV 형식)

출력#

  • Kraken2 분류 보고서

  • Bracken 풍부도 추정치(Kraken2 사용 시)

  • Sylph 프로파일링 결과(Sylph 사용 시)

  • 통계 분석을 위한 Phyloseq 객체(RDS 파일)

  • 통계 분석 결과 및 시각화(–analysiscolumn이 지정된 경우)

출력 디렉토리 구조#

출력은 다음 디렉토리 구조로 구성됩니다:

출력 디렉토리 구조#
${launchDir}/results/metagenome/WMS_TAXONOMY/
├── kraken2/                          # Kraken2 분류 결과
│   ├── ${sample_id}_kraken2.report    # 각 샘플에 대한 분류 보고서
│   └── ...
├── bracken/                          # Bracken 풍부도 추정 결과
│   ├── ${sample_id}_bracken.out       # 각 샘플에 대한 풍부도 추정치
│   └── ...
├── sylph/                            # Sylph 프로파일링 결과(선택한 경우)
│   ├── ${sample_id}.paired.sylsp      # 각 샘플에 대한 Sylph 스케치
│   ├── all.profile-sylph.tsv         # 결합된 Sylph 프로필
│   ├── merged_sylph_species.tsv      # 병합된 종 풍부도 테이블
│   └── ...
├── phyloseq/                         # Phyloseq 객체
│   ├── phyloseq_object.RDS           # Kraken2/Bracken 결과용(사용한 경우)
│   ├── phyloseq_object_sylph.RDS     # Sylph 결과용
│   └── ...
└── stats_analysis/                   # 통계 분석 결과
    ├── alpha_diversity/              # 알파 다양성 측정 및 플롯
    ├── beta_diversity/               # 서열화 플롯 및 PERMANOVA 결과
    ├── differential_abundance/       # 차등 풍부도 테스트 결과
    └── ...

실행 예제 및 결과#

metaFun 명령줄 실행 예제#

metafun_pipeline

Kraken2 출력 예제#

Kraken2 보고서 출력 예제#
$ head -n 10 ${launchDir}/results/metagenome/WMS_TAXONOMY/kraken2/SRR6915091_kraken2.report

100.00  3652288 3652288 U       0       unclassified
0.00    0       0       R       1       root
0.00    0       0       R1      131567  cellular organisms
0.00    0       0       D       2157    Archaea
0.00    0       0       D       2       Bacteria
0.00    0       0       P       1224    Pseudomonadota
0.00    0       0       C       28211   Alphaproteobacteria
0.00    0       0       O       356     Hyphomicrobiales
0.00    0       0       F       41294   Bradyrhizobiaceae
0.00    0       0       G       1073    Rhodopseudomonas

Bracken 출력 예제#

Bracken 풍부도 출력 예제#
$ head -n 10 ${launchDir}/results/metagenome/WMS_TAXONOMY/bracken/SRR6915091_bracken.out

name                                                            taxonomy_id     taxonomy_lvl     kraken_assigned_reads        added_reads     new_est_reads   fraction_total_reads
Bacteroides vulgatus                                            435590          S                62479                        3214            65693           0.01798
Faecalibacterium prausnitzii                                    853                S                41682                        2143            43825           0.01199
Prevotella copri                                                418267          S                38769                        1993            40762           0.01116
Bacteroides uniformis                                            820                S                23683                        1218            24901           0.00682
Blautia obeum                                                   40520           S                22395                        1151            23546           0.00644
Agathobacter rectale                                            39491           S                22009                        1131            23140           0.00633
Bacteroides dorei                                               338188          S                20912                        1075            21987           0.00602
Bacteroides stercoris                                           46506           S                20614                        1060            21674           0.00593
Clostridium bolteae                                             208479          S                18229                        937             19166           0.00525

WMS_TAXONOMY 모듈의 Nextflow 프로세스#

프로세스

InputDir

OutputDir

참고

kraken2_run

${params.inputDir}

${params.outdir}/kraken2

Kraken2를 사용한 분류학적 분류 수행

bracken_run

kraken2_run의 출력

${params.outdir}/bracken

Bracken을 사용한 풍부도 추정

sylph_sketch_all

${params.inputDir}

${params.outdir}/sylph

리드에서 Sylph 스케치 생성

sylph_process_all

sylph_sketch_all의 출력

${params.outdir}/sylph

Sylph 스케치를 처리하고 분류학적 프로필 생성

phyloseq_creation

bracken_run의 출력

${params.outdir}/phyloseq

Bracken 결과에서 Phyloseq 객체 생성

phyloseq_creation_sylph

sylph_process_all의 출력

${params.outdir}/phyloseq

Sylph 결과에서 Phyloseq 객체 생성

statistical_analysis

phyloseq_creation 또는 phyloseq_creation_sylph의 출력

${params.outdir}/stats_analysis

–analysiscolumn이 지정된 경우 통계 분석 수행

WMS_TAXONOMY 워크플로우의 프로세스 설명#

  1. kraken2_run: 메타게놈 리드를 k-mer 기반 분류학적 분류기인 Kraken2를 사용하여 분류합니다.

    • 입력: 페어드 엔드 품질 필터링된 메타게놈 리드

    • 출력: 각 샘플에 대한 Kraken2 분류 보고서

    • 분류학적 할당을 위해 GTDB 데이터베이스 사용

    • 성능 향상을 위해 메모리 매핑 사용 가능

  2. bracken_run: Bracken을 사용하여 Kraken2 결과에서 종 풍부도를 추정합니다.

    • 입력: Kraken2 보고서

    • 출력: 각 샘플에 대한 Bracken 풍부도 추정치

    • Bracken 데이터베이스에 적합한 리드 길이 자동 결정

    • 상대적 풍부도 임계값에 기반하여 결과 필터링

  3. sylph_sketch_all: Sylph를 사용하여 메타게놈 리드의 압축된 스케치를 생성합니다.

    • 입력: 페어드 엔드 품질 필터링된 메타게놈 리드

    • 출력: 각 샘플에 대한 Sylph 스케치(.sylsp 파일)

    • 분류학적 프로파일링을 위한 Kraken2의 빠른 대안

  4. sylph_process_all: Sylph 스케치를 처리하여 분류학적 프로필을 생성합니다.

    • 입력: 모든 샘플의 Sylph 스케치

    • 출력: 결합된 Sylph 프로필 및 종 풍부도 테이블

    • 프로필을 분류학적 분석과 호환되는 형식으로 변환

  5. phyloseq_creation: Bracken 결과에서 Phyloseq 객체를 생성합니다.

    • 입력: Bracken 풍부도 파일 및 메타데이터

    • 출력: RDS 형식의 Phyloseq 객체

    • R에서 분석을 위해 분류학적 및 샘플 메타데이터 통합

  6. phyloseq_creation_sylph: Sylph 결과에서 Phyloseq 객체를 생성합니다.

    • 입력: 병합된 Sylph 종 풍부도 테이블 및 메타데이터

    • 출력: Sylph 결과를 위한 RDS 형식의 Phyloseq 객체

    • phyloseq_creation과 유사하지만 Sylph 특정 형식을 처리

  7. statistical_analysis: 분류학적 프로필에 대한 통계 분석을 수행합니다.

    • 입력: Phyloseq 객체

    • 출력: 알파 다양성, 베타 다양성 및 차등 풍부도 결과

    • –analysiscolumn이 지정된 경우에만 실행

WMS_TAXONOMY에서 사용되는 도구#

도구

목적

버전

기본 매개변수

선택할 수 있는 매개변수

Kraken2

분류학적 분류

2.1.2

--confidence 0.1, --paired

--memory-mapping

Bracken

풍부도 추정

2.7

-l S (종 수준)

-r ${read_length}

Sylph

빠른 분류학적 프로파일링

0.6.1

-c 200 (압축 수준)

이 워크플로우에 특정한 것 없음

R (phyloseq)

통계 분석 및 시각화

4.3.2

N/A

N/A

사용 참고 사항#

  • WMS_TAXONOMY 모듈은 RAWREAD_QC 모듈의 출력과 함께 작동하도록 설계되었습니다.

  • 메타데이터 파일은 CSV 형식이어야 하며, 적어도 하나의 열에는 리드 파일 이름의 접두사와 일치하는 샘플 ID가 포함되어야 합니다.

  • 대규모 데이터셋의 경우, --kraken_method memory-mapping을 사용하면 성능이 크게 향상될 수 있지만, 충분한 시스템 메모리가 필요합니다.

  • 상대적 풍부도 필터(--relab_filter)를 조정하여 종 감지의 민감도를 제어할 수 있습니다 - 값이 낮을수록 희귀한 종이 포함됩니다.

  • Sylph 프로파일러(--profiler sylph)는 Kraken2/Bracken보다 훨씬 빠른 분류학적 프로파일링을 제공하며, 대규모 데이터셋에 좋은 대안이 될 수 있습니다.

  • 이 모듈에서 생성된 Phyloseq 객체는 사용자 정의 분석을 위해 다른 R 패키지와 함께 사용하거나 INTERACTIVE_WMS_TAXONOMY 모듈과 함께 사용할 수 있습니다.

  • 중요한 풍부도 추정 차이: 이 모듈에 포함된 두 프로파일러는 근본적으로 다른 접근 방식을 사용합니다:

    • Sylph는 참조 시퀀스에 대한 전체 게놈 매칭을 기반으로 분류학적 풍부도를 추정하고, Kraken2와 Bracken은 개별 리드를 분류군에 할당하고 데이터베이스 편향을 조정하여 시퀀스 풍부도(리드 수)를 추정합니다(doi: 10.1038/s41592-021-01141-3).

    • 이러한 차이는 프로파일러 간 결과를 비교하거나 다른 분석 방법과 결합할 때 고려해야 합니다.

다음 단계#

WMS_TAXONOMY를 실행한 후, 다음과 같은 작업을 수행할 수 있습니다:

  1. INTERACTIVE_WMS_TAXONOMY 모듈을 사용하여 결과를 대화형으로 탐색:

    (metafun) metafun -module INTERACTIVE_WMS_TAXONOMY -i results/metagenome/WMS_TAXONOMY

    대화형 분석 유연성

    INTERACTIVE_WMS_TAXONOMY 모듈을 사용하면 다음과 같은 작업을 수행할 수 있습니다:

    • -i 매개변수를 사용하여 phyloseq 객체가 포함된 WMS_TAXONOMY 출력 디렉토리를 직접 가리킬 수 있습니다.

    • WMS_TAXONOMY 실행에서 --analysiscolumn을 지정하지 않았더라도 메타데이터 기반 분석을 수행할 수 있습니다.

    • 분류학적 분류를 다시 실행하지 않고도 분석을 위해 서로 다른 메타데이터 변수를 선택할 수 있습니다.

    • 데이터셋의 모든 메타데이터 변수에 걸쳐 분류학적 패턴을 대화형으로 시각화하고 테스트할 수 있습니다.

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