WMS_FUNCTION#
이 모듈은 HUMAnN3을 사용하여 전체 메타게놈 시퀀싱 데이터의 기능 분석을 제공하는 metaFun 파이프라인의 일부입니다.
개요#
WMS_FUNCTION 모듈은 미생물 군집에 존재하는 대사 경로를 식별하기 위해 메타게놈 샘플의 기능적 프로파일링을 수행합니다. UniRef90 단백질 데이터베이스와 MetaCyc 경로 데이터베이스에 리드를 매핑하기 위해 HUMAnN3을 활용하여 포괄적인 기능 프로필을 생성합니다. 이 모듈은 기능 데이터를 샘플 메타데이터와 통합하여 통계 분석 및 시각화를 수행하여 다양한 조건에서 마이크로바이옴의 기능적 잠재력을 보여줍니다.
모듈 실행#
# 품질 필터링된 리드로 기본 사용법
(metafun) metafun -module WMS_FUNCTION -i results/metagenome/RAWREAD_QC/read_filtered -m metadata.csv -s 1
# 메타데이터 열을 기반으로 통계 분석 포함
(metafun) metafun -module WMS_FUNCTION -i results/metagenome/RAWREAD_QC/read_filtered -m metadata.csv -s 1 -a 2
# 사용자 정의 출력 디렉토리 지정
(metafun) metafun -module WMS_FUNCTION -i results/metagenome/RAWREAD_QC/read_filtered -m metadata.csv -s 1 -a 2 -o custom_output_dir
# 특정 CPU 리소스 할당
(metafun) metafun -module WMS_FUNCTION -i results/metagenome/RAWREAD_QC/read_filtered -m metadata.csv -s 1 -a 2 -p 24
모듈 작동 순서#
이 모듈은 다음 단계를 수행합니다:
개별 샘플에 대한 HUMAnN3 분석:
각 샘플에 대한 페어드 엔드 리드 병합
ChocoPhlAn 및 UniRef90 데이터베이스에 대한 핵산 및 번역 검색 수행
MetaCyc 경로 데이터베이스에 리드 매핑
유전자 패밀리 및 경로 풍부도 프로필 생성
인간 리드에 대한 참고 사항: 이 모듈은 이미 인간 DNA 서열을 제거한 RAWREAD_QC의 출력을 사용합니다. HUMAnN3은 MetaPhlAn을 사용한 내장 분류학적 필터링을 통해 남아 있는 호스트 리드를 추가로 처리합니다.
HUMAnN3 출력 파싱 및 정규화:
humann_join_tables를 사용하여 모든 샘플의 경로 풍부도 테이블 결합-u cpm매개변수로humann_renorm_table을 사용하여 CPM(Copies Per Million)으로 정규화CPM 정규화는 샘플 간 공정한 비교를 위해 시퀀싱 깊이에 맞게 유전자 풍부도를 조정합니다.
계산 방법: (pathway_abundance / total_abundance) × 1,000,000
humann_split_stratified_table로 계층화(생물체별) 및 비계층화(군집 수준) 풍부도 테이블 분리
기능 분석 및 시각화:
스크립트 디렉토리에서 R 스크립트
humann3_visualization.R을 사용하여 포괄적인 통계 분석 수행비계층화 경로 풍부도 테이블(
pathabund_join_renorm_cpm_unstratified.tsv)과 메타데이터를 입력으로 사용메타데이터 그룹화를 기반으로 통계 분석 수행:
기능적 풍부도와 균등성에 대한 알파 다양성 계산
PERMANOVA 테스트로 베타 다양성 분석
그룹 간에 차이가 있는 경로를 식별하는 차등 풍부도 분석
다음을 포함한 시각화 생성:
그룹별 경로 풍부도의 스택 막대 그래프(예시 그림의 ①에 표시)
통계적 비교가 있는 알파 및 베타 다양성 박스플롯(예시 그림의 ②에 표시)
차등 풍부한 경로의 히트맵(예시 그림의 ③에 표시)
통계적 유의성이 있는 차등 풍부도 박스플롯(예시 그림의 ④에 표시)
수치 메타데이터 변수와의 상관 분석(예시 그림의 ⑤에 표시)
매개변수#
${launchDir}은 metaFun을 실행하는 디렉토리로, 출력 기본 디렉토리로 활용됩니다.
매개변수 |
설명 |
기본값 |
참고 |
|---|---|---|---|
|
필터링된 리드가 포함된 입력 디렉토리 |
|
필수. RAWREAD_QC 워크플로우의 출력 |
|
메타데이터 파일 경로 |
|
필수. 샘플 정보가 포함된 CSV 파일 |
|
메타데이터에서 샘플 ID의 열 번호 |
|
필수. 리드 파일 이름의 샘플 ID와 일치 |
|
분석 그룹화를 위한 열 번호 |
|
선택 사항. 0으로 설정하면 통계 분석이 수행되지 않음 |
|
사용할 CPU 수 |
|
선택 사항. 시스템 기능에 따라 조정 |
|
출력 디렉토리 |
|
선택 사항. 결과가 저장될 위치 |
입력 및 출력#
입력#
품질 제어된 페어드 엔드 메타게놈 리드(RAWREAD_QC 워크플로우의 출력)
샘플 정보 및 조건이 포함된 메타데이터 파일(CSV 형식)
출력#
각 샘플에 대한 HUMAnN3 유전자 패밀리 및 경로 풍부도 프로필
결합되고 정규화된 경로 풍부도 테이블
통계 분석 결과 및 시각화(–analysiscolumn이 지정된 경우)
출력 디렉토리 구조#
출력은 다음과 같은 디렉토리 구조로 구성됩니다:
${launchDir}/results/metagenome/WMS_FUNCTION/
├── humann3/ # 개별 HUMAnN3 결과 디렉토리
│ ├── SRR6915091_humann3/ # 샘플별 HUMAnN3 결과 디렉토리
│ │ ├── SRR6915091_genefamilies.tsv # 유전자 패밀리 풍부도
│ │ ├── SRR6915091_pathabundance.tsv # 경로 풍부도
│ │ ├── SRR6915091_pathcoverage.tsv # 경로 커버리지
│ │ └── SRR6915091_humann_temp/ # 임시 처리 파일
│ └── ... # 다른 샘플의 결과
├── humann3_combined/ # 결합된 HUMAnN3 결과
│ └── humann_split_stratified_table/ # 분리된 계층화 및 비계층화 테이블
└── WMS_Function_result/ # 통계 분석 결과
├── alpha_diversity.csv # 알파 다양성 메트릭
├── beta_group_perMANOVA_stat.csv # PERMANOVA 통계
├── bray.csv # Bray-Curtis 비유사도 행렬
├── humann_alpha_beta_diversity.pdf # 알파/베타 다양성 그림
├── humann_alpha_group_diff_stat.csv # 그룹 차이 통계
├── humann_beta_group_distance_diff_stat.csv # 베타 다양성 통계
├── humann_beta_group_distance_raw.csv # 원시 거리 값
├── humann_DAfunction_meta_correlation.pdf # 상관 그림
├── humann_group_barplot.pdf # 경로 풍부도 막대 그래프
├── humann_lefse_heatmap.pdf # LEfSe 히트맵 시각화
├── humann_lefse_result.pdf # LEfSe 차등 경로 분석
├── humann_metadata_autocorrelation.pdf # 메타데이터 상관관계
└── jaccard.csv # 자카드 거리 행렬
├── humann_analysis_inspect.log # 분석 로그 파일
└── Rplots.pdf # 추가 R 그림
시각화 출력 설명#
WMS_FUNCTION 모듈은 대조군과 CRC(대장직장암) 그룹을 비교하는 이 예시 그림과 같이 기능 분석을 위한 포괄적인 시각화를 생성합니다:
① 경로 풍부도 스택 막대 그래프#
이 시각화는 각 샘플에서 대사 경로의 상대적 풍부도를 보여줍니다, 조건별로 그룹화됨:
각 수직 막대는 샘플을 나타냄
다른 색상은 다른 대사 경로를 나타냄(범례에 나열됨)
y축은 CPM(Copies Per Million)의 풍부도를 보여줌
샘플은 메타데이터 카테고리별로 그룹화됨(이 예시에서는 대조군 vs. CRC)
이 시각화는 샘플 그룹 간의 기능적 능력의 잠재적 변화를 보여주며, 샘플 그룹 전반에 걸친 지배적인 기능적 능력을 식별하는 데 도움이 됩니다. humann_group_barplot.pdf 파일에 이 시각화가 포함되어 있습니다.
② 기능적 다양성 분석#
이 패널은 기능적 프로필에서 계산된 다양성 메트릭을 표시합니다:
상단 섹션:
알파 다양성: 그룹 간 기능적 다양성을 비교하는 Shannon 다양성 박스플롯
베타 다양성: 그룹 내 및 그룹 간 유사성을 보여주는 Bray-Curtis 거리 박스플롯
통계적 유의성이 표시됨(이 예시에서는 “ns”는 유의하지 않음을 의미)
하단 섹션:
PCoA 그림: 기능적 프로필에 기반한 샘플 관계를 보여주는 주성분 좌표 분석
샘플은 신뢰 타원과 함께 그룹별로 색상이 지정됨
통계 메트릭이 표시됨(Pr(>F), Pseudo-F 통계량, R²)
축은 각 주성분에 의해 설명되는 분산 비율을 보여줌
이 시각화는 humann_alpha_beta_diversity.pdf 파일에서 찾을 수 있으며, 해당 통계는 alpha_diversity.csv, bray.csv, beta_group_perMANOVA_stat.csv 파일에 있습니다.
③ 차등 풍부도 히트맵#
이 시각화는 LEfSe(Linear discriminant analysis Effect Size) 분석의 결과를 보여줍니다:
각 행은 특정 대사 경로를 나타냄
각 열은 조건별로 그룹화된 샘플을 나타냄
색상 강도는 상대적 풍부도를 나타냄(빨간색=높음, 파란색=낮음)
경로는 그룹 간 통계적 유의성에 기반하여 선택됨
히트맵을 통해 한 그룹에서 다른 그룹보다 일관되게 더 풍부한 경로를 식별할 수 있어, 잠재적인 기능적 바이오마커를 제공합니다. 이 시각화는 humann_lefse_heatmap.pdf로 저장됩니다.
④ LEfSe 차등 풍부도 박스플롯#
이 패널은 LEfSe 분석에 의해 식별된 특정 경로의 통계적 비교를 보여줍니다:
각 행은 차등 풍부한 경로를 보여줌
막대는 다른 그룹의 풍부도를 나타냄
x축은 LDA 점수(효과 크기)를 보여줌
별표는 통계적 유의성 수준을 나타냄
막대의 방향과 길이는 어떤 그룹이 더 높은 풍부도를 가지는지 나타냄
이 시각화는 그룹 간 가장 유의하게 다른 경로를 강조하며 humann_lefse_result.pdf로 저장됩니다.
⑤ 메타데이터 상관 분석#
이 포괄적인 패널은 메타데이터 변수 간의 관계를 분석합니다:
상단 행:
범주형 및 수치형 메타데이터 변수의 분포
중간 행:
그룹별 수치 변수(예: host_age)의 분포
변수 간 상관 계수, 전체 및 그룹별
하단 행:
그룹별 다른 수치 변수(예: BMI)의 분포
그룹별로 색상이 지정된 수치 변수 간의 관계를 보여주는 산점도
그룹 간 분포를 비교하는 밀도 그림
이 분석은 기능적 프로필에 영향을 미칠 수 있는 잠재적 교란 변수나 메타데이터 간의 상관관계를 식별하는 데 도움이 됩니다. 이 시각화는 humann_metadata_autocorrelation.pdf 및 humann_DAfunction_meta_correlation.pdf로 저장됩니다.
이러한 시각화를 통해 높은 수준의 경로 풍부도 패턴에서 특정 차등 경로 및 메타데이터 변수와의 관계에 이르기까지 기능적 메타게놈 데이터의 포괄적인 분석이 제공됩니다.
WMS_FUNCTION 모듈의 Nextflow 프로세스#
프로세스 |
InputDir |
OutputDir |
참고 |
|---|---|---|---|
humann3_run |
|
|
개별 샘플에 대한 HUMAnN3 분석 수행 |
humann3_parsing |
humann3_run의 출력 |
|
HUMAnN3 출력 결합 및 정규화 |
function_analysis |
humann3_parsing의 출력 |
|
통계 분석 및 시각화 수행 |
WMS_FUNCTION 워크플로우의 프로세스 설명#
humann3_run: 각 샘플의 페어드 엔드 리드에 대해 HUMAnN3을 실행합니다.
입력: 페어드 엔드 품질 필터링된 메타게놈 리드
출력: 각 샘플에 대한 유전자 패밀리 및 경로 프로필
처리를 위해 페어드 리드 병합
UniRef90 단백질 데이터베이스 및 MetaCyc 경로 데이터베이스 사용
핵산 및 번역 검색 모두 수행
humann3_parsing: 모든 샘플의 HUMAnN3 출력을 결합하고 정규화합니다.
입력: 모든 샘플의 HUMAnN3 출력 파일
출력: 결합되고 정규화된 경로 풍부도 테이블
모든 샘플에 걸쳐 테이블 조인
CPM(copies per million)으로 정규화
계층화(생물체별) 및 비계층화(군집 수준) 테이블 분리
function_analysis: 통계 분석을 수행하고 시각화를 생성합니다.
입력: 정규화된 경로 풍부도 테이블 및 메타데이터
출력: 통계 결과 및 시각화
조건 간 차등 풍부한 경로 식별
히트맵, PCA 그림, 박스플롯 생성
–analysiscolumn이 지정된 경우에만 실행
WMS_FUNCTION에서 사용되는 도구#
도구 |
목적 |
버전 |
기본 매개변수 |
선택할 수 있는 매개변수 |
|---|---|---|---|---|
HUMAnN3 |
기능적 프로파일링 |
3.0.0 |
|
|
MetaPhlAn |
분류학적 프로파일링(HUMAnN3에서 사용) |
4.0.6 |
|
이 워크플로우에 특정한 것 없음 |
R |
통계 분석 및 시각화 |
4.3.2 |
N/A |
N/A |
사용 참고 사항#
WMS_FUNCTION 모듈은 RAWREAD_QC 모듈의 출력과 함께 작동하도록 설계되었습니다.
메타데이터 파일은 리드 파일 이름의 접두사와 일치하는 샘플 ID가 포함된 열이 하나 이상 있는 CSV 형식이어야 합니다.
HUMAnN3은 특히 대규모 데이터셋에 대해 상당한 계산 리소스가 필요합니다.
-p매개변수로 CPU 할당을 조정하는 것을 고려하세요.HUMAnN3 데이터베이스(ChocoPhlAn 및 UniRef90)가 적절히 설치되고 구성되어야 합니다.
통계 분석 구성 요소는
-a/--analysiscolumn매개변수가 유효한 열 번호로 지정된 경우에만 실행됩니다.최적의 결과를 위해 리드가 적절히 품질 필터링되었고 호스트 DNA가 제거되었는지 확인하세요.
HUMAnN3은 계층화(생물체별) 및 비계층화(군집 수준) 기능 프로필을 모두 제공하여 특정 경로에 어떤 생물체가 기여하는지 상세 분석할 수 있습니다.
CPM 정규화 이해하기#
이 모듈에서 사용되는 Copies Per Million(CPM) 정규화는 샘플 간 경로 풍부도의 정확한 비교를 위해 중요합니다:
CPM이란? CPM은 각 값을 샘플의 총 풍부도로 나누고 100만을 곱하여 리드 수를 정규화합니다.
왜 CPM을 사용하나요? 다른 샘플은 종종 다른 시퀀싱 깊이를 가집니다. 정규화 없이는 더 많은 시퀀싱을 가진 샘플이 단순히 더 많은 리드로 인해 더 높은 경로 풍부도를 가진 것처럼 보일 수 있습니다. CPM은 이러한 차이를 고려하여 공정한 비교를 가능하게 합니다.
구현: 정규화는 다음 명령으로
humann_renorm_table유틸리티에 의해 수행됩니다:humann_renorm_table -i pathabund_join.tsv -o pathabund_join_renorm_cpm.tsv -u cpm