WMS_STRAIN

WMS_STRAIN#

이 모듈은 InStrain을 사용하여 전장 메타게놈 시퀀싱 데이터의 균주 수준 분석을 제공하는 metaFun 파이프라인의 일부입니다.

개요#

WMS_STRAIN 모듈은 미생물 집단 내 미세다양성(microdiversity)을 특성화하기 위한 균주 수준 분석을 수행합니다. InStrain을 활용하여 단일 염기 변이(SNV)를 프로파일링하고, 뉴클레오타이드 다양성 지표를 계산하며, 샘플 간 균주 집단을 비교합니다. 이 모듈은 선택압 분석을 위한 pN/pS 비율, 뉴클레오타이드 다양성(π) 값, 샘플 간 균주 공유 패턴을 포함한 종합적인 지표를 생성합니다.

모듈 실행#

# WMS_TAXONOMY의 phyloseq 객체를 사용한 기본 사용법
(metafun) metafun -module WMS_STRAIN -i results/metagenome/RAWREAD_QC/read_filtered \
    --phyloseq_object results/metagenome/WMS_TAXONOMY/phyloseq/phyloseq_object_sylph.RDS

# 사용자 정의 prevalence 필터링
(metafun) metafun -module WMS_STRAIN -i results/metagenome/RAWREAD_QC/read_filtered \
    --phyloseq_object results/metagenome/WMS_TAXONOMY/phyloseq/phyloseq_object_sylph.RDS \
    --prevalence_threshold 10 --min_abundance 0.001

# 외부 메타데이터 파일 사용
(metafun) metafun -module WMS_STRAIN -i results/metagenome/RAWREAD_QC/read_filtered \
    --phyloseq_object results/metagenome/WMS_TAXONOMY/phyloseq/phyloseq_object_sylph.RDS \
    -m metadata.csv -s 1

# CPU 리소스 지정
(metafun) metafun -module WMS_STRAIN -i results/metagenome/RAWREAD_QC/read_filtered \
    --phyloseq_object results/metagenome/WMS_TAXONOMY/phyloseq/phyloseq_object_sylph.RDS \
    -p 24

모듈 작동 순서#

이 모듈은 다음 단계를 수행합니다:

  1. Prevalence 필터링 (phyloseq 객체로부터):

    • prevalence 임계값 기반 분류군 필터링 (기본값: 샘플의 5%)

    • 최소 풍부도 필터 적용 (기본값: 0.1%)

    • prevalent 분류군을 GTDB 게놈과 매칭

    • phyloseq 또는 외부 파일에서 샘플 메타데이터 추출

  2. 게놈 준비:

    • GTDB 데이터베이스에서 참조 게놈 가져오기

    • 게놈을 결합된 참조 FASTA로 연결

    • Scaffold-to-bin (STB) 매핑 파일 생성

    • 리드 매핑을 위한 Bowtie2 인덱스 구축

  3. 유전자 주석:

    • 개별 게놈에 대해 Prodigal 실행 (병렬화)

    • 유전자 예측 결과 연결 (단백질, 유전자, GFF)

    • 기능 주석을 위한 eggNOG-mapper 실행 (COG 카테고리)

  4. 리드 매핑:

    • Bowtie2를 사용하여 품질 필터링된 리드를 결합된 참조에 매핑

    • 각 샘플에 대해 정렬된 BAM 파일 생성

    • 효율적인 접근을 위한 인덱스 파일 생성

  5. InStrain 프로파일링 (개별 샘플):

    • 각 샘플을 프로파일링하여 균주 수준의 SNV 검출

    • Nei and Li (1979) 방법으로 뉴클레오타이드 다양성(π) 계산

    • 선택압 평가를 위한 pN/pS 비율 계산

    • 유전자 수준 및 게놈 수준 지표 생성

  6. InStrain 비교 (샘플 간):

    • 모든 샘플 간 균주 집단 비교

    • 샘플 쌍 간 popANI 및 conANI 계산

    • 공유 균주 식별 (기본값: 99.999% popANI 임계값)

    • 다운스트림 분석을 위한 비교 행렬 생성

  7. 데이터 집계 (시각화용):

    • 모든 샘플의 프로파일 결과 결합

    • GTDB 분류 및 샘플 메타데이터와 통합

    • INTERACTIVE_STRAIN 모듈용 RDS 파일 준비

매개변수#

${launchDir}은 metaFun을 실행하는 디렉토리로, 출력 기본 디렉토리로 활용됩니다.

매개변수

설명

기본값

참고

-i, --input_dir

필터링된 리드가 포함된 입력 디렉토리

필수

RAWREAD_QC 워크플로우의 출력

--phyloseq_object

WMS_TAXONOMY의 Phyloseq RDS 파일

필수

prevalence 필터링을 위한 phyloseq 객체 경로

-m, --metadata

메타데이터 파일 경로

선택 사항

CSV 파일; 제공하지 않으면 phyloseq에서 추출

-s, --sampleIDcolumn

메타데이터의 샘플 ID 열 번호

1

리드 파일 이름의 샘플 ID와 일치

--prevalence_threshold

prevalence 최소 샘플 %

5

분류군이 이 % 이상의 샘플에 존재해야 함

--min_abundance

최소 상대적 풍부도 임계값

0.001

0.1% 미만 풍부도의 분류군 필터링

--min_coverage

InStrain 최소 커버리지

5

높을수록 더 신뢰성 있는 결과

--min_freq

최소 SNP 빈도 임계값

0.05

저빈도 변이 필터링

--min_read_ani

리드 할당을 위한 ANI 임계값

0.92

0.92=균주, 0.95=종, 0.99=클론

-p, --cpus

사용할 CPU 수

자동 감지

시스템 기능에 따라 조정

-o, --outdir

출력 디렉토리

"${launchDir}/results/metagenome/WMS_STRAIN"

결과가 저장될 위치

입력 및 출력#

입력#

  • 품질 제어된 페어드 엔드 메타게놈 리드 (RAWREAD_QC 워크플로우의 출력)

  • WMS_TAXONOMY의 Phyloseq 객체 (분류 및 샘플 메타데이터 포함)

  • 선택 사항: phyloseq 메타데이터를 대체할 외부 메타데이터 파일 (CSV 형식)

출력#

  • GTDB 게놈 매칭이 포함된 prevalent 분류군 목록

  • 각 샘플에 대한 InStrain 프로파일 결과

  • 게놈별 뉴클레오타이드 다양성 지표

  • pN/pS 비율 테이블 (유전자 수준 및 게놈 전체)

  • 균주 비교 행렬 (popANI, conANI)

  • INTERACTIVE_STRAIN 시각화를 위한 전처리된 RDS 파일

출력 디렉토리 구조#

출력은 다음 디렉토리 구조로 구성됩니다:

출력 디렉토리 구조#
${launchDir}/results/metagenome/WMS_STRAIN/
├── 01_prevalent_taxa/                    # Prevalence 필터링 결과
│   ├── prevalent_taxa_taxonomy_ids.txt   # 필터링된 분류군 ID
│   ├── prevalent_taxa_metadata.tsv       # prevalent 분류군의 GTDB 메타데이터
│   ├── prevalent_taxa_genome_paths.txt   # GTDB 게놈 경로
│   ├── prevalence_summary.tsv            # Prevalence 통계
│   └── sample_metadata.csv               # 추출/제공된 샘플 메타데이터
├── 02_genome_prep/                       # 게놈 준비
│   ├── all_genomes_combined.fa           # 연결된 참조 게놈
│   ├── prevalent_taxa.stb               # Scaffold-to-bin 매핑
│   └── bowtie2_index/                    # Bowtie2 인덱스 파일
├── 03_gene_annotation/                   # 유전자 예측 및 주석
│   ├── genes.faa                         # 단백질 서열
│   ├── genes.fna                         # 유전자 서열
│   ├── genes.gff                         # 유전자 주석 (GFF 형식)
│   └── eggnog_results.emapper.annotations # eggNOG 기능 주석
├── 04_bam_files/                         # 리드 매핑 결과
│   ├── ${sample_id}.sorted.bam           # 정렬된 BAM 파일
│   └── ${sample_id}.sorted.bam.bai       # BAM 인덱스 파일
├── 05_instrain_profiles/                 # InStrain 프로파일 결과
│   ├── ${sample_id}_instrain_profile/    # 샘플별 프로파일 디렉토리
│   │   ├── output/                       # 주요 출력 파일
│   │   │   ├── ${sample_id}_genome_info.tsv    # 게놈 수준 지표
│   │   │   ├── ${sample_id}_gene_info.tsv      # 유전자 수준 지표
│   │   │   └── ${sample_id}_scaffold_info.tsv  # Scaffold 지표
│   │   └── raw_data/
│   │       └── genes_SNP_count.csv.gz    # pN/pS 계산을 위한 SNP 카운트
│   └── validation_summary.txt            # 프로파일 검증 결과
├── 06_instrain_compare/                  # InStrain 비교 결과
│   └── instrainComparer_output/
│       └── output/
│           ├── comparisonsTable.tsv      # 페어와이즈 샘플 비교
│           └── genomeWide_compare.tsv    # popANI/conANI 지표
└── 07_shiny_data/                        # 시각화를 위한 전처리된 데이터
    ├── integrated_microbiome_data.rds    # 결합된 R 데이터 객체
    ├── pN_pS_gene_level.rds              # 유전자 수준 pN/pS 데이터
    ├── pN_pS_genome_wide.rds             # 게놈 전체 pN/pS 데이터
    └── eggnog_annotations_subset.rds     # 필터링된 eggNOG 주석

주요 지표 설명#

뉴클레오타이드 다양성 (π)#

뉴클레오타이드 다양성은 Nei and Li (1979) 방법을 사용하여 집단 내 유전적 변이를 측정합니다:

공식: π = 1 - Σ(각 염기의 빈도)²

InStrain은 충분한 커버리지(기본값 ≥5x)를 가진 모든 게놈 위치에서 π를 계산하고 유전자/게놈 전체의 평균을 구합니다. 이 지표는 샘플 간 커버리지 차이에 강건합니다.

  • 높은 π: 많은 SNV를 가진 다양한 균주 집단을 나타냄

  • 낮은 π: 균질한 집단 또는 최근의 선택적 스윕을 나타냄

pN/pS 비율#

비동의 치환과 동의 치환의 비율로, 선택압을 나타냅니다:

  • pN/pS < 1: 정화 (음성) 선택 - 유해한 돌연변이 제거

  • pN/pS ≈ 1: 중립 진화 - 선택압 없음

  • pN/pS > 1: 양성 선택 - 유익한 돌연변이 선호

Population ANI (popANI) 및 Consensus ANI (conANI)#

InStrain은 균주 비교를 위해 두 가지 ANI 지표를 계산합니다:

  • popANI (집단 수준 ANI): 주요 및 소수 대립유전자를 모두 고려하여 샘플 내 미세다양성을 설명합니다. popANI 치환은 샘플 간 공유 대립유전자가 없을 때만 호출됩니다.

  • conANI (합의 ANI): 샘플 간 합의(주요) 대립유전자만 비교합니다. conANI 치환은 샘플의 주요 대립유전자가 다를 때 호출됩니다.

공유 균주 식별에는 99.999% popANI 기본 임계값이 권장됩니다. 자세한 내용은 InStrain 문서를 참조하세요.

WMS_STRAIN 모듈의 Nextflow 프로세스#

프로세스

입력

출력

참고

prevalence_filter_phyloseq

Phyloseq RDS

01_prevalent_taxa

prevalence로 분류군 필터링

concat_genomes

GTDB 게놈 경로

02_genome_prep

참조 게놈 연결

generate_stb

GTDB 게놈 경로

02_genome_prep

scaffold-to-bin 매핑 생성

bowtie2_build

결합된 FASTA

02_genome_prep/bowtie2_index

Bowtie2 인덱스 구축

prodigal_per_genome

개별 게놈

작업 디렉토리

유전자 예측 (병렬화)

concat_gene_predictions

Prodigal 출력

03_gene_annotation

유전자 예측 연결

eggnog_mapper

단백질 서열

03_gene_annotation

기능 주석

bowtie2_mapping

필터링된 리드

04_bam_files

참조에 리드 매핑

instrain_profile

BAM 파일

05_instrain_profiles

균주 수준 변이 프로파일링

validate_instrain_profiles

프로파일 디렉토리

05_instrain_profiles

프로파일 검증

instrain_compare

유효한 프로파일

06_instrain_compare

샘플 간 균주 비교

aggregate_for_shiny

모든 출력

07_shiny_data

시각화 데이터 준비

WMS_STRAIN에서 사용된 도구#

도구

목적

버전

기본 매개변수

선택 가능한 매개변수

Bowtie2

리드 매핑

2.5+

--sensitive-local --no-unal

--threads ${task.cpus}

InStrain

균주 프로파일링

1.8+

--min_cov 5, --database_mode

-p ${task.cpus}, --min_read_ani

Prodigal

유전자 예측

2.6.3

-p single (게놈별)

N/A

eggNOG-mapper

기능 주석

2.1+

-m mmseqs

--cpu ${task.cpus}

samtools

BAM 처리

1.17+

-@ ${task.cpus}

N/A

사용 참고 사항#

  • WMS_STRAIN 모듈은 prevalence 필터링을 위해 WMS_TAXONOMY의 phyloseq 객체가 필요합니다.

  • Prevalent 분류군은 참조 기반 분석을 위해 자동으로 GTDB 게놈과 매칭됩니다.

  • 메타데이터는 phyloseq 객체에서 추출하거나 -m 매개변수를 통해 별도로 제공할 수 있습니다.

  • InStrain은 상당한 계산 리소스가 필요합니다. CPU 할당은 자동 감지되지만 -p로 조정할 수 있습니다.

  • 높은 커버리지 샘플이 더 신뢰성 있는 균주 수준 지표를 제공합니다. 평균 커버리지 < 5x인 샘플은 균주 해상도가 제한될 수 있습니다.

  • 모듈은 자동으로 InStrain 프로파일을 검증하고 유효한 프로파일이 2개 미만이면 비교를 건너뜁니다.

  • 최적의 결과를 위해 풍부하고 prevalent한 분류군에 집중하도록 적절한 --prevalence_threshold를 사용하세요.

다음 단계#

WMS_STRAIN 실행 후:

  1. INTERACTIVE_STRAIN 모듈을 사용하여 결과를 대화형으로 탐색:

    (metafun) metafun -module INTERACTIVE_STRAIN -i results/metagenome/WMS_STRAIN/07_shiny_data

  2. 심층 분석 수행:

    • 조건에 따른 뉴클레오타이드 다양성 패턴 조사

    • 선택을 받는 유전자 식별을 위한 pN/pS 비율 분석 (COG 기능 카테고리)

    • popANI 임계값을 사용한 샘플 그룹 간 균주 집단 비교

    • 균주 수준 지표와 메타데이터 변수의 상관관계 분석

WMS_STRAIN 모듈은 미생물 군집 내 균주 수준 다양성에 대한 종합적인 통찰을 제공하여, 연구자들이 어떤 종이 존재하는지뿐만 아니라 해당 종 내의 유전적 변이를 이해할 수 있게 합니다.

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